Лечение воспалительных заболеваний кишечника аллогенными мезенхимальными стромальными клетками

Биологические свойства мезенхимальных стромальных клеток и обоснование их клинического применения

В последние десятилетия в мире отмечается рост заболеваемости ЯК и БК, о чем свидельствуют результаты проведенных больших контролируемых исследований [21]. ВЗК наиболее широко распространены в развитых странах, в частности, в Европе и Северной Америке [17].

В этих регионах частота возникновения ЯК и БК (первичная заболеваемость) колеблется от 4 до 20 случаев на 100 000 человек, составляя при этом в среднем 8-10 случаев в год. Распространенность составляет от 30 до 240 случаев, ежегодный прирост заболеваемости составляет 5-20 случаев [71,213].

При этом пик возрастания ВЗК приходился на 60-70-е годы XX столетия и был отмечен в США, Великобритании, Скандинавии. Прослеживался интересный факт: рост ЯК предшествовал росту БК, который следовал через интервал в 15-20 лет [115]. Эта закономерность подтверждена многочисленными исследованиями, проведенными в Швеции, Ирландии, Дании [114,309].

Еще недавно средний уровень заболеваемости ЯК в Северной Европе был на 40 %, а БК — на 80 % выше, чем в Южной Европе [68]. В последнее десятилетие отмечается значительный рост заболеваемости в странах бассейна Средиземного моря [115]. По материалам проводимых Международных конгрессов по изучению ВЗК, в последующие десятилетия прогнозируется рост заболеваемости ЯК и БК в странах Азии и Восточной Европы [17]. По данным R.Sandier [339] распространенность ВЗК на 100000 населения в Италии составляет 121, в США- 116, в Канаде- 37,2.

Масштабных эпидемиологических исследований в РФ не проводилось, однако, по данным Белоусовой Е.А. [3], в Московской области на 1997 г. ВЗК составляли: распространенность — 3,5 на 100 000 населения, заболеваемость -0,3 на 100 000 населения (2002г). Наибольшее число случаев приходится на возраст 20 — 40 лет.

В лечении ЯК и БК достигнут определённый прогресс, но у значительной части больных эффективность данной терапии остаётся низкой. Это связано с прогрессирующим рецидивирующим течением, развитием тяжелых, угрожающих жизни осложнений, необходимостью пожизненной, дорогостоящей терапии глюкокортикоидами, иммуносупрессорами и другими препаратами системного действия, неэффективностью хирургического лечения.

Патогенез БК и ЯК обусловлен сложными взаимодействиями генетических, экологических, микробных и иммунных факторов. Возможность найти новые методы терапии ВЗК может дать только комплексный подход в изучении патогенеза данной патологии с позиций различных дисциплин, таких как молекулярная микробиология, иммунофизиология и нейроиммунология.

Хронические ВЗК сопровождаются повышенной циркуляцией цитокинов с различными функциональными свойствами. Продуцируемые Т-хслперами I и II типа, цитокины стимулируют как клеточный, так и гуморальный иммунный ответ, регулируют межклеточные коммуникации, развитие интегрированной реакции со стороны иммунной системы [278].

Иммунная система слизистой оболочки кишки характеризуется тонко регулируемыми динамическими взаимодействиями между иммунными и неиммунными клетками, чтобы обеспечивать соответствующий иммунологический баланс между хозяином и симбиотической микрофлорой просвета кишки.

Эти взаимодействия обеспечиваются между самими иммунными клетками и эпителиальными клетками. Межклеточное взаимодействие происходит посредством прямого взаимодействия с рецепторами клеточной поверхности или путем высвобождения растворимых медиаторов, таких как цитокины.

Хорошо известно, что баланс между про- и противовоспалительными цитокйнами у больных БК и ЯК отсутствует [85]. Многочисленные исследования предоставляют четкие доказательства того, что присутствие регуляторных цитокинов, ингибирующих презентацию антигенов, и провоспалительных цитокинов, вызывающих или стимулирующих апоптоз активированных иммунных клеток, является ведущим механизмом, обеспечивающим физиологический баланс в слизистой оболочки кишки.

В течение последних десятилетий стало очевидным, что развитие ЯК и БК связано с выраженными нарушениями иммунной системы [68,162]. Пусковыми механизмами иммунного дисбаланса могут являться бактериальные антигены и их токсины, а также аутоантигены [31].

Накоплено множество доказательств, указывающих на иммунные нарушения как на существенный компонент механизма воспаления и разрушения тканей при этой патологии. Любая острая и хроническая воспалительная реакция осуществляется посредством специфической и неспецифической активации большого числа клеток, либо циркулирующих в крови, либо скапливающихся в месте поражения [150].

Оценка типа и численности Т- и В-клеток, макрофагов, эозинофилов, тучных и других клеток в слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта и крови больных ВЗК — потенциал для сбора информации о типе иммунного ответа, вызванного патологическим процессом.

Однако литературные данные, освещающие состояние клеточного иммунитета, весьма противоречивы. В некоторых сообщениях идет речь о тенденции к снижению числа Т-клеток и возрастанию В-клеток на фоне обострения, что расценивается как явление вторичное, и полученные результаты не могут дать полное представление об изменениях, происходящих в клеточном звене иммунитета в патогенезе ВЗК [278,370].

Тем не менее, Т-лимфоциты являются ключевыми медиаторами клеточного иммунитета и осуществляют иммунорегуляторные функции в норме и участвуют в развитии гастроинтестинальных заболеваний. Выявлено, что мононуклеарные клетки формируют воспалительный инфильтрат кишечника в активной стадии заболевания [133].

Выяснилось, что несмотря на абсолютное возрастание числа лимфоцитов пропорционально степени местного воспаления [298], относительные пропорции клеток, инфильтрирующих ткань, таких как подгруппы Т-клеток, практически не отличаются от тех, что обнаруживаются в слизистой оболочке в норме.

Другие типы клеток, наоборот, претерпевают изменения, при этом меняется не только их число, но и тип. Например, известно, что снижение преобладающих в норме IgA-продуцирующих плазматических клеток сопровождается возрастанием в той же пропорции иммуноцитов IgG, обычно составляющих не более 5% от всего пула плазматических клеток [198].

Предполагается, что состояние активации клеток слизистой оболочки кишечника также существенно меняется, на что указывает возрастание пропорции клеток с поверхностно-клеточными активными маркерами, такими как CD25 (lL-2Ra), Т9, 4F2 и др. или высокие уровни иммунных генов [345,346].

Ведущим показателем считается соотношение CD4 : Т-хелперов 1 типа (Txl) и Т-хелперов 2 типа (Тх2). Функции этих клеток определяются профилем выработки цитокинов [327]. Первые опосредуют воспалительные и цитотокси-ческие реакции, вторые обеспечивают антителообразование и торможение функций Txl.

Характер иммунного ответа при том или ином заболевании, или в разные фазы патологического процесса при одном и том же заболевании зависит, как полагают, от преимущественной активации Txl или Тх2. Тип определяется характером антигена и находится под генетическим и гормональным контролем.

Воспалительные и аутоиммунные заболевания можно условно разделить на группы по доминирующему субклассу активированных Т лимфоцитов. Так, при БК соотношение Тх1/Тх2 в слизистой оболочке сдвинуто в сторону Txl и заболевание ассоциировано с Txl-типом иммунного ответа [133].

С целью четкого определения типов Т -клеток, участвующих в развитии воспалительного процесса при БК, был произведен анализ Т-клеточных рецепторов (TCR). В норме в слизистой оболочке кишки человека, как внутри эпителия, так и в собственной пластинке, значительно больше Т-клеток с TCR&p, чем клеток с TCRyS.

При БК возрастание числа Т-клеток в период активной стадии процесса осуществляется почти полностью за счет TCRdp-позитивных клеток, но меняется соотношение внутриэпителиальных TCRy5-no3HTHBHbix клеток и TCRy5-клеток собственной пластинки слизистой оболочки [95,145].

Методы исследования

Анти HJI-6R — гуманизированные моноклональное антитело к Ил-бЯ (MRA) было разработано для лечения активной БК [183]. Исследования эффективности и безопасности препарата продолжаются.

Анти-ИЛ-2 рецептор (CD25) антител (даклизумаб и базиликсимаб). Дак-лизумаб является гуманизированным IgGl рекомбинантным моноклональным антителом к рецепторам ИЛ-2 (CD25), который блокирует связывание ИЛ-2 с Ил — 2 рецепторами. Открытое экспериментальное исследование даклизумаба продемонстрировало эффективность у больных с активным течением ЯК [3, 398].

Апй-ИЛ-12 — человеческое моноклональное антитело к ИЛ-12р40. Проводится II фаза многоцентровых рандомизированных плацебо-контролируемых испытаний [244] безопасности и эффективности у больных активной БК. Неблагоприятные явления среди больных, получающих анти-ИЛ-12, были такими же как и среди больных, получавших плацебо, за исключением местных реакций в месте инъекции.

Фонтолизумаб (anti-IFN-y) является гуманизированным моноклональным антителом к ИНФ-у. В фазе I / II эскалации дозы исследовании [319] у больных умеренной и тяжелой формой активной БК был отмечен дозозависимый эффект [397]. Исследования продемонстрировали хорошую безопасность и переносимость препарата, но необходимы дальнейшие исследования.

Еще одной мишенью для биологического лечения считаются молекулы адгезии, которые играют большую роль в развитии воспаления при ВЗК, вызывают миграцию клеток из сосудистого русла в очаг воспаления, т.е. способст вующие усилению воспалительной инфильтрации слизистой оболочки и хомингу лимфоцитов.

В настоящее время идентифицированы три основных семейства молекул адгезии: 1) суперсемейство иммуноглобулинов (клеточные молекулы адгезии — intercellular adhesion molecule — ICAM 1, ICAM 2, ICAM 3 и др. на моноцитах и клетках эндотелия, молекулы адгезии на эндотелиальных клетках мелких сосудов — small vessels adhesion molecule — VCAM); 2) семейство интегринов, экспрессируемых на лимфоцитах и нейтрофилах; 3) семейство селектинов (ELAM), в которое входят L, Ри Е-селектины на эндотелиальных клетках.

Активность эндотелиальных клеток и их участие в развитии воспаления не менее важно, чем влияние клеток воспалительного инфильтрата, и зависит как от их основных функций, так и от взаимодействия между лейкоцитарными и эндотелиальными молекулами адгезии и цитокинами в разные фазы воспаления.

Натализумаб является рекомбинантным, гуманизированным монокло-нальным антителом IgG4 к а4 интегрину, который блокируют патологические эффекты молекул адгезии, уменьшают хоуминг лейкоцитов и способствуют заживлению язвенных дефектов [329]. Препарат был исследован для поддержания ремиссии при БК [333].

Поддерживающая терапия натализумабом продемонстрирована эффективность при активной БК [152,156]. В больших третьем этапе исследования у больных с активной БК не было обнаружено преимуществ перед плацебо [316]. Ретроспективный анализ показал эффективность натализумаба в подгруппе больных с повышенной концентрацияей СРБ, по сравнению с плацебо [316].

Внутривенное введение натализумаба 3 мг/кг продемонстрировало клиническое преимущество у больных активным ЯК [155]. Несмотря на этот многообещающий результат поддерживающей терапии, лечение натализумабом было приостановлено после нескольких случаев прогрессирующей мультифокалыюй лейкоэнцефалопатии.

Заболевние почти всегда возникает у больных СПИДом, лейкемией или поциентов, перенесших трансплантацию органов, является фатальной оппортунистической инфекцией централь ной нервной системы, вызванных активизацией вирусами полиомиелита. Но в последнее время прпарат вернулся на рынок в США для больных БК с множеством рекомендаций по безопасности.

MLN-02 — гуманизированный G1 иммуноглобулин (IgGl) к ( 4р7 интегри-ну, селективно ингибирует адгезию лейкоцитов на слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта, препятствуя ее инфильтрации лимфоцитами. Рандомизированное плацебо-контролируемое иследование [128] было проведено у больных с БК.

Отмечались побочные эффекты (тошнота и назофарингит), но пациенты не прекратили лечение. Фаза I / И, двойного слепого плацебо-контролируемого исследование безопасности и эффективности у 28 больных с умеренно выраженной ЯК продемонстрировала, что MLN-02 в целом хорошо переносится и эффективен для лечения активного ЯК [128].

Аликафорсен (ISIS 2302) — антитело к оиРг-интегрину, известному как антигену функции лейкоцитов (LFA) -1, и его лиганду, молекуле межклеточной адгезии-1 (ІСАМ-1). Положительные результаты были получены при внутривенном введении [415] препарата, а в двух последующих плацебо-контролируемых исследований не удалось продемонстрировать эффективность у больных с подкожными введением препарата.

Удалось подтвердить эффективность препарата при использовании высоких доз у 40 больных с дистальной формой ЯК [402,416]. Гормон роста человека и различные факторы роста, такие как TGF-р, который выделяется Th3 клетками и обеспечивает отрицательную обратную связь в дифференциации наивных Т-хелперов на ТЫ или ТЪ2 подтипы, эпидермальный фактора роста (ЭФР) и фактор роста-1 кератиноцитов (KGF-1), могут играть важную роль в патогенезе ВЗК [64].

Потенциально их можно использовать для лечения и восстановления целостности слизистой оболочки кишки. Гормон роста человека является пептидом, увеличивающим всасывание электролитов в кишечнике, уменьшающим проницаемость кишечной стенки и индуцирующим экспрессию инсулиноподобного фактора роста I, ко торый в свою очередь, стимулирует синтез коллагена.

В единственном плацебо-контролируемом исследовании [357] было продемонстрировано снижение индекса Беста среди больных умеренной и тяжелой БК, которые получили подкожные гормона роста в течение четырех месяцев, по сравнению с плацебо. Тем не менее, о выходе больных в ремиссию не сообщается. Необходимы дополнительные контролируемые испытания с использованием традиционных показателей улучшения и ремиссии.

Сравнительный анализ клинического течения язвенного колита в группах больных

Оценка клинической и эндоскопической активности ЯК проводилась через 2, б, 12 и 24 месяца Исходный уровень показателя клинической активности до начала терапии составил в 1-й группе 8,3±0,26 баллов, во 2-й — 8,1±0,2, а в 3-й, соответственно, — 8,5±0,5; статистической разницы по группам по исходному индексу клинической активности не было (р 0,05).

Наиболее полную информацию об активности, протяженности и патологических изменениях кишки при ЯК дают эндоскопические методы исследования. По исходному индексу эндоскопической активности различий в группах так же не было (р 0,05).Уровень показателя эндоскопической активности до начала терапии составил в 1-й группе 7,7±0,3 баллов, во 2-й — 7,2±0,4, а в 3-й — 8,2±0,4.

Статистической разницы между 1-й и 2-й групп по исходному индексу эндоскопической активности не было (р 0,05), эндоскопическая активность была несколько выше в 3-й группе, так как терапию инфликсимабом получали больные с более тяжелым течением ЯК (таблица 21). с момента включения больного в группу наблюдения.

При оценке полученных результатов учитывали диарею, наличие патологических примесей в стуле, боли в животе, лихорадку, общее самочувствие, а так же некоторые лабораторные показатели. Выяснилось, что через 2 мес. по ряду показателей индексов клинической и эндоскопической активности отмечалось достоверное снижение по сравнению с исходным уровнем и между группами (МСК и 5-АСК/ГКС), что в последующем было подтверждено сравнительным анализом между группами через 6 и 12 месяцев.

Полученные данные подтвердили наличие и местного и системного воздействия МСК на течение ЯК (таблицы 22 и 23). В течение первого года наблюдения сравнивались 1-я и 2-я группа больных, так как большинство больных, получающих инфликсимаб, еще не окончили курс поддерживающей терапии, продолжающийся в течение года.

Изменение индекса клинической активности в баллах (по Рахмилевичу) в 1-й и 2-й группах больных ЯК представлено в таблице 22.

Из таблицы 24 видно, что через 2 месяца индекс клинической активности достоверно ниже во 2-й группе больных, получающих более высокие дозы ГКС и иммунодепрессанты. Через 6 месяцев наблюдения картина меняется в сторону уменьшения индекса клинической активности в 1-й группе больных, и увеличению его во 2-й группе.

Увеличение обусловлено как ухудшением клинико-лабораторных показателей в данной группе без явных признаков обострения, так и наличием больных с обострением заболевания за полгода наблюдения. Стабильность индекса 1-й группы сохраняется на протяжении 12 месяцев, в то время как тенденция к нарастанию клинической активности ЯК отмечается у группы больных, получающих препараты 5-АСК и ГКС.

Суммарный индекс клинической активности через 2 месяца у больных 1-й группы достоверно снизился в среднем с 8,3±0,26 до 1,55±0,3 баллов, у больных 2-й группы — с 8,1±0,2 до 1,4±0,2 баллов, в группе больных 3-й группы, получающих инфликсимаб — с 8,5±0,5 до 1,3±0,2.

В таблице 25 показана динамика индекса эндоскопической активности Мейо в группах больных ЯК через 2, 6, 12 и 24 месяцев лечения. Величина индекса у больных 1-й группы составляла 7,7±0,3, у больных 2-й группы — 7,2±0,4 балла, в 3-й группе — 8,2±0,42. Через 2 месяца индекс достоверно снизился в 1-й, 2-й и 3-й группах до 1,16±0,09 (р 0,05)

, 1,43±0,15 (р 0,05), 1,2±0,1 баллов (р 0,05) соответственно, объективно подтверждая уменьшение морфологических признаков воспаления слизистой оболочки толстой кишки. В дальнейшем индекс эндоскопической активности ЯК уже значительно отличался: у больных 1-й группы через 6 и 12 месяцев он продолжал снижаться и составил 0,7±0,15 и 0,76±0,15 баллов, приближаясь к уровню ремиссии, и через 24 месяца он составил 0,68±0,1.

Таким образом, трансплантация аллогенных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга способствует снижению индекса клинической активности воспалительного процесса при ЯК через 12 месяцев с 8,3±0,26 до 1,8±0,3 баллов (в группе сравнения с 8,1±0,2 до 2,9±0,4 баллов) при р 0,05.

Индекс клинической активности ЯК через 24 месяца наблюдения сопоставим в группах больных, которым проведена трансплантация МСК и терапия ИНФ (р 0,05). Так же трансплантация аллогенных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга способствует снижению индекса эндоскопической активности у больных ЯК с 7,7±0,3 до 0,76±0,2 (в группе сравнения с 7,2±0,4 до 2,6±0,4) при р 0,05 и сопоставима с терапией инфликсимабом (р 0,05).

Физиологическое и патологическое накопление радиоактивно тс99ш меченых мезенхимальных стромальных клеток в тканях и органах

Несмотря на значительные достижения в изучении патогенеза ВЗК не нашел объяснения тот факт, почему одни лица ЯК и БК имеют клинически тяжелые и часто рецидивирующие формы заболевания, а другие — легкие и редко рецидивирующие, а так же почему в одних случаях патогенетическая терапия ВЗК эффективна, а в других — нет.

Необходимо искать факторы, которые могут прогнозировать ответ на терапию, позволят более эффективно использовать метод лечения. Например, наиболее быстрый отклик на терапию инфликсимабом имели пациенты с биологически активным воспалением, о котором свидетельствовало увеличение С-реактивного белка [317, 236].

Лучше отвечают на лечение инфликсимабом пациенты с нестриктурирующей формой заболевания при локализации воспалительного процесса в ободочной кишке [230,405]. Получавшие сопутствующую иммуносупрессивную терапию с большей вероятностью ответят и на краткосрочную и пролонгированную терапию инфликсимабом [54,405,280], тогда как курильщики ответят на лечение данным препаратом с меньшей вероятностью [268,280].

Необходимо отметить, что лечение больных ВЗК дорого обходится национальным системам здравоохранения. Например, в Великобритании, прямые затраты на лечение больных БК составляют более 2000 в год на одного больного, в Бельгии — 2500 за 6 месяцев. При этом основная часть затрат (43%) приходится на госпитализации, включая хирургическое лечение.

Медико-социальная значимость ВЗК определяется их вкладом в структуру заболеваемости людей активного трудоспособного возраста, а также высоким уровнем затрат, включающих медицинские и немедицинские расходы. Кроме этого, ВЗК является заболеванием, развитие и течение которого сопровождается резким снижением качества жизни больных.

В условиях рыночной экономики одной из важных проблем фармакотерапии является рациональный индивидуальный подход к терапии ВЗК, оптимально сочетающих эффективность, безопасность и стоимость [7].

Как известно, анализ «стоимости болезни» (cost of illness) — подразумевает оценку прямых (direct cost) и непрямых затрат (indirect cost), выраженных в денежных единицах. Прямые затраты (расходы) определяются как непосредственные расходы, связанные с оказанием медицинской помощи, и включают [11,18] расходы на содержание больного в лечебном учреждении (гостиничные услуги) или стоимость оказываемых ему на дому услуг, в том числе средним медицинским персоналом: стоимость профессиональных медицинских услуг (плата за врачебные консультации, оплата рабочего времени врачей и медицинских сестер); стоимость лекарственных препаратов (ЛП); стоимость лабораторного и инструментального обследования; стоимость медицинских процедур (таких, как хирургические операции, реабилитационные мероприятия, санитар-но-противоэпидемические мероприятия); стоимость транспортировки больного санитарным транспортом; стоимость питания больного в стационаре; плата за использование медицинского оборудования, площадей и средств (распределение фиксированных затрат из статей бюджета); коррекция побочных эффектов лекарственных препаратов.

Следует отметить, что исследования, посвященные изучению экономической составляющей диагностики и лечения ВЗК, носят фрагментарный характер, не дают комплексной оценки фармакоэкономической обоснованности существующих затрат. Более того, высокие затраты на диагностику ВЗК и неудовлетворенность результатами лечения ЯК и БК делают необходимым проводить анализ затрат различных схем лечения ВЗК.

В связи с этим мы провели сравнительный фармакоэкономический анализ различных методов лечения ЯК и БК с учетом затрат, эффективности и безопасности применения МСК, инфликсимаба, препаратов 5-АСК и иммуносупрессоров. Трансплантация мезенхимальных стромальных клеток при лечении тяжелых, рефрактерных форм различных заболеваний в настоящее время не является стандартной терапией и требует дальнейшего проведения клинических исследований, однако уже сейчас эффективность данного метода убеждает в необходимости расширения дальнейших исследований.

До широкого внедрения этого вида терапии в клиническую практику необходимо будет решать вопрос об определении четких клинических, эндоскопических, иммунологических показаний для данного метода лечения. Накопленный клинический опыт свидетельствует, что аллогенная трансплантация МСК имеет ряд преимуществ перед аутологичной трансплантацией, первоначальные результаты демонстрируют безопасность данного метода терапии.

На данный момент времени до конца не определены механизмы действия аллогенных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга. Публикации о клеточной терапии БК не дают ответ на вопрос об оптимальных сроках, частоте и необходимом количестве клеточного материала.

Пока нет четких клинических, эндоскопических и лабораторных показаний для трансплантации МСК с целью достижения оптимального эффекта от данного вида терапии МСК. Остается открытым вопрос о месте трансплантации МСК в схеме лечения БК, а сведеня о данном методе терапии при ЯК вообще единичные.

Положительные предварительные результаты, проводимых в различных странах мира клинических и экспериментальных исследований, обосновывают актуальность, перспективность и достаточную безопасность метода трансплантации аллогенных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга для лечения больных ВЗК.

На все неясные вопросы может ответить более тщательно подготовленная следующая фаза испытаний метода клеточной терапии. Эффективность и безопасность трансплантации стволовых клеток [60] еще предстоит доказать в многочиленных исследованиях, однако уже сейчас можно говорить о перспективности этого метода, который может стать дополнением, а иногда альтернативой прочим методам лечения ВЗК и значительно улучшить качество жизни больных Неоходимо еще раз отметить, что применение стволовых клеток не является самостоятельным методом лечения болезней человека.

Российский ученый Александр Максимов в 1908 году и в 1960-70 годы советские ученые Иосиф Чертков и Александр Фриденштейн провели пионерские работы по изучению биологии стволовых клеток, и их исследования были продолжены по всему миру.